工学院陈匡时课题组在基于CRISPR的单分子成像DNA技术领域取得新进展

来源 : 学历在线网 2019-12-10 16:50:26

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　　最近，工学院生物医学工程系陈匡时">陈匡时课题组基于CRISPR基因编辑技术与分子信标 (MB) 研制出一种名为CRISPR/MB的新型单基因位点成像技术。该研究成果已发表于Nucleic Acids Research (《核酸研究》) (IF = 10.162)，题目为“A CRISPR/Molecular Beacon Hybrid System for Live-Cell Genomic Imaging”。

　　CRISPR基因编辑技术是一种能够有效且稳定地将目的基因敲除的方法。该技术是由Cas9 蛋白与single-guide RNA (sgRNA) 组成。Cas9 是一种DNA 内切酶，sgRNA则同时具有能和特定基因组序列互补的位点(spacer 序列) 以及和Cas9 结合的结构域。因此，Cas9在与sgRNA 形成复合体后能通过spacer 序列靶向特定基因位点并将其破坏，从而达到定点编辑基因组的目的。前人的研究发现，失去酶切活性的Cas9 (nuclease-deactivated Cas9, dCas9) 也能够通过结合sgRNA 靶向特定基因组，由此开创了使用dCas9与sgRNA 成像特定基因组的研究领域。

　　目前，基于CRISPR技术在活细胞中标记基因组的方法主要通过将荧光蛋白连接于dCas9 或sgRNA上实现成像。但是荧光蛋白具有亮度低、易被光漂白以及不能被淬灭等缺点，在单分子成像单基因位点上能力有限。本研究所使用的分子信标 (MB)则是一种基于化学荧光基团、具有可淬灭特性的寡核苷酸探针 (图一)，其两端分别连有一个化学荧光基团和一个淬灭基团，在不与目的RNA结合时MB通过自身形成茎环结构呈现出低荧光状态，而在与目的RNA互补后茎结构解离进入高荧光状态，MB因其独特的成像优势成为目前活细胞标记内源RNA的主要手段之一。通过改造sgRNA 的结构，陈匡时">陈匡时实验室巧妙地将MB与CRISPR技术结合起来，成功研制出带有MB靶序列(MTS)的sgRNA (SL2-sgRNA-MTS)，并证实 dCas9 和SL2-sgRNA-MTS 能形成稳定的复合体，并与特定的单基因位点结合。MB进入细胞后能与复合体中的MTS 互补，使得该基因位点被荧光标记。荧光成像显示，被标记后的单基因位点在传统荧光显微镜下呈现单一亮点 (图二)。CRISPR/MB的研发与应用有望帮助研究者对目的基因组在细胞核的转运与定位，及其与疾病的发生发展的关系等科学问题进行更深入的阐述。

　　该工作的第一作者是吴小天。毛诗琦、杨艳涛等学生为工作的顺利完成做出重要贡献。通讯作者为工学院陈匡时">陈匡时特聘研究员。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、北京市自然科学基金的支持。

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